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基于PPAR通路的冠心病痰瘀互结证小鼠

摘要:目的基于过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)通路探讨冠心病痰瘀互结证小鼠模型的发病机制。方法健康C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组和假手术组,载脂蛋白E基因敲除(ApoE?/?)雄性小鼠随机分为血瘀组、痰浊组、痰瘀互结组。痰浊组和痰瘀互结组小鼠给予高脂饲料喂养12周,其余各组小鼠给予普通饲料喂养12周。在8周末时,对血瘀组和痰瘀互结组小鼠进行冠状动脉左前降支结扎,假手术组小鼠行穿线不结扎。酶联免疫法测定血清白细胞介素-6(IL-6)、内皮素(ET)、血管紧张素II(AngII)、PPARγ水平,免疫印迹法检测肝脏组织PPARγ、ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、CD36蛋白表达水平,免疫组化方法检测主动脉基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、CD40、核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平。结果与假手术组比较,各组小鼠血清中IL-6水平未出现显著变化,痰瘀互结组小鼠血清ET水平显著升高(P<0.01),血瘀组小鼠血清中AngII水平显著升高(P<0.05),痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中AngII水平显著升高(P<0.01),PPARγ水平降低;在肝脏组织中,血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠PPARγ、ABCA1蛋白表达水平显著降低(P<0.01),CD36蛋白表达水平升高;主动脉组织中CD40、MMP-9、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论冠心病痰瘀互结证发病过程中会造成较为严重的动脉粥样硬化斑块,可能是通过激活PPARγ通路实现的。

《中国心血管病报告》概要显示,中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段,其中冠心病患者有万,死亡率继续呈上升趋势,且男性冠心病死亡率高于女性[1-2]。冠心病有动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)与心肌缺血的双重病理特征,中医将AS与血脂的升高作为“痰”的表现,将心肌缺血和血液流变学的变化作为“瘀”的表现,故冠心病易表现出痰瘀等病理症状[3]。研究发现,冠心病心血瘀阻证及痰浊内阻证所占比例呈逐步增高趋势,特别是痰浊内阻证。冠心病已成为中国乃至全世界的主要致死原因,阐明其发生机制已经成为研究热点。

本实验采用冠状动脉左前降支结扎联合高脂饲料喂养载脂蛋白E基因敲除(ApoE?/?)小鼠建立冠心病痰瘀互结证模型,通过多种实验方法检测小鼠血清、肝脏、主动脉组织相关指标的变化,探讨冠心病痰瘀互结证发展机制,为开展方证对应关系的相关研究及中药作用机制研究提供可参考的动物模型。

1材料

1.1实验动物

SPF级6周龄ApoE?/?小鼠40只、同龄具有相同遗传背景的C57BL/6J小鼠30只由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物许可证号为SCXK(京)-,医院实验动物中心,饲养期间保持环境温度(22±2)℃,湿度(50±10)%,自由进食和饮水。

1.2试剂与仪器

白细胞介素-6(IL-6)、内皮素(ET)、血管紧张素II(AngII)、过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)ELISA试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司;PPARγ一抗购自美国CST公司;ATP结合盒转运体A1(ABCA1)、CD36、CD40、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、核转录因子-κB(NF-κB)一抗购自Abcam公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自沈阳碧云天生物技术研究所。

多功能微孔板分析仪(MolecularDevices公司);低温高速离心机(Eppendorf公司);电泳仪、转膜仪(美国GE公司)。

2方法

2.1实验分组及模型建立

将40只ApoE?/?小鼠随机分成血瘀组(15只)、痰浊组(10只)和痰瘀互结组(15只),将30只C57BL/6J小鼠随机分成对照组(15只)和假手术组(15只)。实验期间痰浊组和痰瘀互结组小鼠喂养高脂饲料12周,其余各组小鼠全程给予普通饲料喂养12周。痰浊组小鼠采用高脂饲料喂养12周,期间死亡2只。血瘀组小鼠采用普通饲料喂养,在冠状动脉左前降支进行结扎,剔除死亡小鼠5只,继续饲养至12周。痰瘀互结组小鼠手术方法同血瘀组,同时给予高脂饲料喂养,造模过程中死亡6只,后期饲养过程中死亡2只。假手术组小鼠手术方法同血瘀组,但只进行穿线不结扎。

2.2ELISA法检测血清中IL-6、ET、AngⅡ、PPARγ表达水平

在第12周末,剪去小鼠胡须,采用摘眼球取血法,从小鼠眼眶静脉丛采集血液标本,收集于离心管中,室温静置30min后,在4℃以r/min离心15min,分离血清后,放置于?80℃冰箱保存,用于检测血清IL-6、ET、AngII、PPARγ水平,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.3Westernblotting法检测肝脏组织PPARγ、ABCA1、CD36蛋白表达水平

末次给药取血后,取小鼠肝脏组织,放于?80℃保存。提取肝脏组织总蛋白后,用二喹啉甲酸(BCA)进行蛋白定量。每泳道上样蛋白40μg,SDS-PAGE电泳、凝胶湿法转膜后,加入兔抗小鼠PPARγ、ABCA1、CD36抗体(1∶),4℃封闭过夜,加入山羊抗兔IgG(1∶)反应后,使用发光成像系统进行曝光。

2.4免疫组化法检测主动脉组织CD40、MMP-9、NF-κB蛋白表达水平

末次给药取血及肝脏组织后,剥离小鼠主动脉组织。主动脉组织切片后浸入0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0),反复加热至沸腾,冷却后PBS洗涤,滴加5%BSA封闭液,室温20min,滴加一抗(1∶)后4℃孵育过夜。洗涤后滴加生物素标记二抗,20~37℃孵育30min,洗涤后滴加试剂SABC,使用DAB显色试剂盒复染。常规脱水、透明、封片备用。

2.5统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析,实验数据以表示,多组间比较使用单因素方差齐性分析(One-wayANOVA)。

3结果

3.1小鼠血清IL-6、ET、AngII、PPARγ水平变化

与对照组比较,假手术组小鼠血清中IL-6、ET、AngII、PPARγ水平未出现明显变化;血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中IL-6水平均未出现显著变化;血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中ET、AngII水平显著升高(P<0.05、0.01);血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中PPARγ水平降低,但差异不显著。与假手术组比较,血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中IL-6水平均未出现显著变化;痰瘀互结组小鼠血清ET水平显著升高(P<0.01);血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中AngII水平显著升高(P<0.05、0.01);血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠血清中PPARγ水平降低,但差异不显著。与血瘀组比较,痰瘀互结组小鼠血清中ET水平显著升高(P<0.05);痰瘀互结组小鼠血清中AngII水平显著升高(P<0.01)。与痰浊组比较,痰瘀互结组小鼠血清中AngII水平显著升高(P<0.05)。见表1。

3.2小鼠肝脏组织PPARγ、ABCA1、CD36蛋白水平变化

与对照组比较,假手术组小鼠肝脏组织PPARγ、ABCA1蛋白表达水平降低,CD36蛋白表达水平升高,但差异不显著;血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠肝脏组织中PPARγ、ABCA1蛋白表达水平显著降低(P<0.01),CD36蛋白表达水平升高,但差异不显著。与假手术组比较,血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠肝脏组织PPARγ、ABCA1蛋白表达水平显著降低(P<0.01),CD36蛋白表达水平升高,但差异不显著。与血瘀组比较,痰浊组和痰瘀互结组小鼠肝脏组织PPARγ、ABCA1蛋白表达水平显著降低(P<0.05、0.01),CD36蛋白表达水平有明显的上调趋势,但差异不显著。与痰浊组比较,痰瘀互结组小鼠肝脏组织ABCA1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),见图1。

3.3小鼠主动脉组织CD40、MMP-9、NF-κB蛋白表达水平变化

与对照组比较,假手术组小鼠主动脉组织CD40蛋白表达水平降低,MMP-9、NF-κB蛋白表达水平升高,但差异不显著。与假手术组比较,血瘀组、痰浊组和痰瘀互结组小鼠主动脉组织CD40、MMP-9、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与血瘀组比较,痰瘀互结组小鼠主动脉组织CD40、MMP-9、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与痰浊组比较,痰瘀互结组小鼠主动脉组织CD40蛋白表达水平显著升高(P<0.01),MMP-9蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表2、图2。

4讨论

血瘀指机体内有血液停滞,离经之血蓄积体内,或血运不畅,阻滞于经脉及脏腑内的血液。冠状动脉左前降支结扎术可以直接有效地阻断冠状动脉,常被用于冠心病心肌缺血和梗死模型的制备,孙娟等[4]、石洪涛等[5]和郭淑贞等[6]采用该方法成功在大鼠、小鼠、猪冠状动脉左前降支结扎,建立心肌缺血和梗死模型,实验结果显示左心室射血分数(EF)、左心室短轴收缩率(FS)显著降低。高脂血症及高血糖等AS致病因素皆可称之“血中之痰浊”,其中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的升高是痰浊的主要特征和生化物质基础[7-8]。沈伟等[9]通过冠状动脉左前降支结扎联合高脂饲料喂养成功建立小鼠AS和心肌梗死双模型,更接近临床疾病状态。课题组前期在高脂饲料喂养的基础上联合冠状动脉左前降支结扎的方法成功建立冠心病痰瘀互结证小鼠模型[10],结果表明痰瘀互结组小鼠的EF、FS显著降低,血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C显著升高,主动脉窦处有明显的粥样斑块,主动脉管腔显著狭窄,主动脉大体油红O染色斑块面积显著,具有明显的心肌缺血和AS的特点。本实验以前期实验模型为基础,通过检测PPARγ通路相关指标,进一步探讨冠心病痰瘀互结证发病机制。

AS斑块的形成是平滑肌细胞的迁移过程,此过程和基质金属蛋白酶(MMPs)密切相关,尤其是与MMP-2和MMP-9,其通过降解平滑肌细胞周围的胶原破坏斑块的稳定性[11]。在AS不稳定性斑块中会出现巨噬细胞数量增多、基质减少、胶原降解、MMP-9表达过量,证明AS斑块的稳定性和MMP-9的高表达相关[12-13]。CD40与CD40L为一对互补的跨膜糖蛋白,二者结合则成为炎症信号转导通路的重要成分,参与AS形成、斑块的不稳定性和血栓的形成过程。CD40L的高表达会刺激免疫反应,引起炎症瀑布效应,导致AS斑块形成和血小板活化。研究表明AS斑块中巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞均可表达CD40和CD40L,从而通过调节MMPs的表达降低斑块稳定性[14-15]。核转录因子NF-κB一般情况下与NF-κB抑制蛋白(IκB)相结合,以p65和p50构成的不活跃的二聚体形式存在。当细胞被激活,IκB磷酸化,NF-κB与IκB解离,NF-κB二聚体活化,迁移进入细胞核,激活细胞因子、白细胞介素等相关因子表达,从而加剧局部的炎症反应和AS斑块的不稳定性。研究显示AS斑块中NF-κB的表达增加,并且发现NF-κB的激活和冠状动脉的损伤程度有直接联系[16-17]。在正常动脉壁中巨噬细胞上的CD36表达水平较低,而CD36在斑块中泡沫细胞的表达则明显升高,表明CD36在AS斑块形成过程的巨噬细胞泡沫化中有重要作用。研究结果显示在肝脏中CD36的基础表达水平较低,但在高脂饮食的诱导下CD36的表达水平显著升高[18-20]。

ABCA1属于大分子跨膜蛋白,参与胆固醇的逆向转运,在肝、肠和巨噬细胞中高度表达。ABCA1能够把过量的胆固醇从细胞内向细胞外运输,输送到载脂蛋白并将其包装成HDL-C。细胞内的胆固醇流出增多,会减轻细胞的泡沫化程度,进而延缓AS的发生发展,成为AS治疗的一个重要目标[21-22]。PPARγ属于一类配体调控的核转录因子,研究结果显示PPARγ既能调节LDL-C的摄取,又能调节胆固醇的流出,进而影响AS的形成过程[23]。激活的PPARγ通过激活蛋白、信号转导和转录活化因子信号通路,抑制与AS斑块发生和发展相关的多种黏附分子和炎症因子的基因表达,通过抑制促炎因子的表达,减轻炎症反应,减少MMPs的产生,抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞等,从而延缓AS的发展,发挥稳定AS斑块的作用[24-25]。此外PPARγ还能减少单核细胞黏附在血管壁上,以减轻AS,表明PPARγ有心血管保护作用[26]。

本实验中,小鼠血清中ET和AngII水平升高,表明冠心病痰瘀互结证会对血管内皮细胞造成损伤,利于脂质在血管内膜沉积,形成AS斑块。小鼠主动脉组织中CD40、MMP-9和NF-κB蛋白表达水平均明显升高,表明冠心病痰瘀互结证发病过程中会造成较为严重的AS斑块。痰瘀互结组小鼠肝脏组织中CD36蛋白表达水明显升高,说明冠心病痰瘀互结证增加组织对脂肪酸和胆固醇摄入、储存和利用,同时抑制ABCA1的表达,使机体胆固醇逆向转运功能下降,从而造成体内胆固醇蓄积和AS病变,此外还通过下调PPARγ的表达促进炎症反应的发展,加速AS病变,这为探索冠心病痰瘀互结证的发病机制提供了实验依据。

中医在治疗冠心病痰瘀互结证时采用益肾健脾、涤痰散结、清热化痰、活血通络、益气养阴、化痰活血等辨证论治的方法,佐以活血化瘀药、理气药、化痰药、补虚药等。任得志等[27]将痰瘀互结型冠心病不稳定型心绞痛患者68例分为对照组和治疗组,对照组给予常规化学药治疗,治疗组在常规化学药基础上加服丹蒌片,连续治疗4周后,临床结果显示丹蒌片能明显改善患者临床症状,调节血脂,具有一定的稳定斑块作用。肖志文[28]采用自拟益气逐瘀降浊汤治疗60例痰瘀互结兼气虚患者,该汤所含方药为党参、瓜蒌、白术、半夏、陈皮、丹参、桃仁、川芎、炙甘草、桂枝,结果显示益气逐瘀降浊汤能有效地改善胸痹的主要症状。谭延文[29]在小陷胸汤中加入丹参组成丹参陷胸汤,用于治疗冠心病痰瘀互结证时疗效良好。本实验的模型和结果为中药治疗痰瘀互结证研究提供了可靠的模型和实验依据。本课题组将以此模型为基础,进一步研究中药治疗冠心病痰瘀互结证的作用机制。

参考文献(略)

来源:冯曼,殷佳,王鹏伟,高树明,李琳,高杉,于春泉.基于PPARγ通路的冠心病痰瘀互结证小鼠发病机制研究[J].中草药,,51(5):-.

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